大战绿妖之后，蜘蛛侠彼得·帕克（托比·马奎尔 饰）忍痛拒绝了他唯一的挚爱玛丽（克尔斯滕·邓斯特 饰），因为蜘蛛侠的身份会为自己和亲人带来巨大危险，帕克决定独立承担起蜘蛛侠的责任。 帕克一直在忙于应付各种挑战：学习超能力的灵活运用；在超级英雄与平凡大学生的双重身份下隐藏自我、小心翼翼地生活等等。帕...克对玛丽越来越难以自拔，但是作为蜘蛛侠又不能对玛丽展开心扉。 好友哈利（詹姆斯·弗兰科 饰）因为误会蜘蛛侠而一直处处与其作对；唯一的亲人婶婶也对蜘蛛侠的真实身份产生了怀疑。同时，新的挑战又出现了：邪恶而强大的章鱼博士（阿尔弗雷德·莫里纳 饰）。帕克在种种压力下肩负起蜘蛛侠的使命。
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